蒸汽消毒型凍干機采用在位滅菌裝置SIP(121oC蒸汽滅菌,雙氧水滅菌裝置)，從根本上避免了無菌室的二次污染問題。可消毒的波紋管套有效地防止了液壓油的污染。使用蒸汽消毒的凍干機本身相當于一臺高壓消毒柜，凍干箱和水汽凝結器均使用蒸汽消毒，因此它們必須不僅能耐受負壓，而且要耐受正壓，二者均裝有安全放氣閥，為了消毒后冷卻系統，大型凍干機的凍干箱和水汽凝結器均設計成雙層夾套式結構，以便用冷卻水進行冷卻，大型凍干機的箱門也是雙層夾套式結構。凍干機的箱門需適合耐正壓，因此普遍采用像高壓消毒柜那樣的輻射桿式鎖緊裝置，并裝有安全設備，當凍干箱內處于正壓和高溫時，凍干箱門無法打開。
為了提高消毒效果和縮短消毒時間，消毒方式均為預真空式，因此凍干機帶有一臺水環式真空泵，除抽空系統之外，還用于消毒結束后抽除水分，作為系統的干燥之用。
為了適應蒸汽消毒的高溫（最高達138℃），凍干箱板層內的傳溫流體需采用耐高溫型流體。現在大都采用硅油；也有采用三氯乙烯的，但需用氮氣加壓，以提高沸點。真空測量頭也要求采用耐高溫高壓型的探頭。最好使用電容式真空儀表。對于帶有箱內壓塞裝置的凍干機，為了達到嚴格消毒的目的，在液壓活塞桿上應加上一個不銹鋼的波紋管套管。
現代凍干機的蒸汽消毒可以預先編制程序，全自動地進行操作。蒸汽消毒大致有如下步驟：
1． 關閉凍干箱和水汽凝結器與外界相通的閥門，關閉真空泵和水汽凝結之間的閥門。
2． 用水環式真空泵抽空系統，鎖緊箱門。
3． 放入蒸汽進行升溫，抽空系統，重復三次。
4． 在規定的溫度進行保溫或保壓。
5． 冷卻干燥階段，用水環式真空泵進行抽空，并用冷凍機降溫。
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